חקירת ההשפעות ומנגנון הפעולה של חומרים אנטי- היפרגליקמיים חדשים לטיפול בסוכרת מסוג 2

האוניברסיטה העברית בירושלים הפקולטה לרפואה, בית הספר לרוקחות חקירת ההשפעות ומנגנון הפעולה של חומרים אנטי- היפרגליקמיים חדשים לטיפול בסוכרת מסוג 2 Effects and Mechanism of action of novel antihyperglycemic compounds for the treatment of type- 2 diabetes לילי פסטרנק בהנחיית: פרופ' שלמה ששון במסגרת הלימודים לקבלת תואר מוסמך בביה"ס לרוקחות האוניברסיטה העברית בירושלים דצמבר 2012 תשע ג טבת

עבודת מחקר זו נעשתה בהדרכתו של: פרופ' שלמה ששון המחלקה לפרמקולוגיה, בית הספר לרוקחות, הפקולטה לרפואה, האוניברסיטה העברית בירושלים. 2

תודות לפרופ' שלמה ששון על הסיוע הרב, ההדרכה המסורה וההכוונה המקצועית במהלך התואר. לדר' אריה גרוזמן על העזרה וההכוונה במהלך המחקר. לחברי המעבדה, גיא, עופר, יעל, אריאלה, קלרה, יוסף ודוחא על הסיוע, החברות והתמיכה שהעניקו לי. תודה מיוחדת למשפחתי ולעומר היקרים, על התמיכה והעידוד לאורך כל הדרך. 3

תקציר סוכרת מסוג 2 מאופיינת בתנגודת פריפרית לאינסולין ותפקוד לקוי של תאי בטא. בתחילה, מסת שרירי השלד, הכבד ורקמת השומן הופכים רגישים פחות לפעילות האינסולין. תאי הבטא בלבלב מפצים על התנגודת הפריפרית לאינסולין על ידי הפרשת יתר של אינסולין, אולם לאורך זמן כשל בתאי הבטא גורם למחסור ביצירת והפרשת אינסולין. בהמשך מופיעה ומחמירה תופעת ההיפרגליקמיה. תופעה זו גורמת לרוב סיבוכי הסוכרת ועל כן, מטרת מרבית הטיפולים התרופתיים היא הורדת רמות הגלוקוז בדם. (2,4;3,5-Di-O- EH-36,D-Xylose במעבדתנו בעבר נמצא כי נגזרות סינטתיות של ה- benzylidene-d-xylose-diethyl-dithioacetal) (2,4-O-benzylidene-D-Xylose- ו- EH-40,diethyl-dithioacetal) מגבירות את קצב כניסת הגלוקוז בסיבי שריר שלד מחולדה ומאדם באופן התלוי באנזים.AMPK אולם, נדרש עדיין שיפור במאפיינים של נגזרות אלו ולכן הכנו חומרים יעילים יותר. לאחר ethoxybenzo-thiazol סריקה ראשונית של 30 למעלה מ- ה- של נגזרות החדשות, התמקדנו בחקירת (2-(propylthio)benzo[d]thiazol-6-ol) EMM-45 החומר של הפעילות אשר בלט בתכונותיו הפרמקוקינטיות. המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה לאפיין את ההשפעות ואת המנגנון של EMM-45 על הגברת קצב קליטת גלוקוז בשרירי שלד ועל הגברת הפרשת אינסולין מתאי בטא. מחקר זה מראה כי החומר EMM-45 מגביר פי 2.5 את קצב כניסת הגלוקוז לסיבי שריר בשלד L6 בתוך 5 שעות ובעל EC 50 של 17. µm כמו כן, נמצא כי חומר זה מפעיל את האנזים.AMPK בנוסף, חקרנו 2 EMM-45 את ההשפעה של EMM-45 החומר על הפרשת אינסולין מתאי בטא. החומר את פי הגביר הפרשת האינסולין מתאי ה-,INS-1E באופן מירבי בריכוז 25, µm עם EC 50 של 8. µm בנוסף, מצאנו כי בדומה לתאי שריר השלד, ההשפעה של EMM-45 בתאי בטא מתווך מתווכת על ידי האנזים.AMPK לסיכום, הפעילות הכפולה של EMM-45 מערבת שתי מטרות מרכזיות בטיפול בסוכרת- סילוק הגלוקוז מהדם אל רקמות המטרה והגברת הפרשת האינסולין מתאי הבטא בלבלב. התכונות של חומר זה הופכות אותו לבעל פוטנציאל להמשך פיתוח תרופתי עבור טיפול בסוכרת מסוג 2. 4

Abstract Type 2 diabetic is characterized by peripheral insulin resistance and impaired β- cell function. The skeletal muscle mass, liver and adipose tissue become less sensitive to the action of insulin. Initially pancreatic β-cells compensate for the peripheral insulin resistance by hyper-secretion of insulin, but over time, a progressive β-cell failure leads to insulin deficiency that subsequently results in hyperglycemia. We have previously synthesized some D-Xylose derivatives that augmented glucose transport in hyperglycemic rat and in human cultured myotubes in an AMPKα-dependent manner. Yet, there was a need to improve their antidiabetic and pharmacokinetic functions. Therefore, we sought for more potent and effective compounds. After an initial screening of the newly designed and synthesized ethoxybenzo-thiazol derivatives, we focused on the leading compound EMM-45 (2-(propylthio)benzo[d]thiazol-6-ol), a compound that seems to be the most promising. The main goal of this research project was to characterize the effects and mechanism of action of EMM-45 in skeletal muscle and in insulin secreting beta cells. This work shows that EMM-45 augments the rate of glucose transport in L6 myotubes (2.5-fold) within 5 hours, with an EC 50 of 17 µm, and it activates the enzyme AMPK. Additionally, we investigated the effect EMM-45 on insulin secretion. EMM-45 increased 2-fold insulin secretion from -cells (INS-1E). EMM-45 maximally increased insulin secretion at 25 µm with an EC 50 of 8 µm. Furthermore, we have found that the target for EMM-45 action in β-cells is also the enzyme AMPK. In conclusion, the dual functionality of EMM-45 and its properties make this compound a potential candidate for a further drug development. 5

תוכן עניינים רשימת קיצורים...7 מבוא... 8 מטרות העבודה... 18 חומרים ושיטות...19 תוצאות... 25 דיון... 41 ביבליוגרפיה...51 נספחים... 56 6

רשימת קיצורים AICAR - 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside AMP - Adenosine monophosphate AMPK - 5' Adenosine monophosphate-activated protein kinase ATP - Adenosine triphosphate BSA - Bovine Serum Albumin dglc - 2-Deoxy-d-glucose DMSO - Dimethylsulphoxide EDTA - Ethylenediaminetetraacetic acid EGTA - Ethyleneglycoltetraacetic acid FBS- Fetal Bovine Serum GLUT - Glucose Transporter HEPES - N-[2-Hydroxyethyl] Piperazine N - [2- ethane sulfonic acid] α-mem - α-minimum Essential Medium MTT - Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide OPD - o-phenilendiamine PBS - Phosphate Buffered Saline PFA - Paraformaldehyde PMSF - Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride RIA - Radioimmunoassay SDS - Sodium dodecyl sulfate SGLT - sodium-dependent glucose transporter 7

מבוא: מחלת הסוכרת - רקע כללי מחלת הסוכרת הינה מהמחלות הנפוצות ביותר באוכלוסיית האדם ועל פי אירגון הסוכרת הבינלאומי מספר החולים במחלה בשנת 2011 היה מעל 360 מיליון איש, וצפוי לעלות למעלה מ- 550 מיליון איש עד לשנת התסמונת הבולטת ביותר במחלה זו היא עלייה ממושכת ובלתי מבוקרת ברמת הגלוקוז בדם, תופעה 1. 2030 הנקראת היפרגליקמיה. ללא טיפול תרופתי יעיל להורדת רמות הגלוקוז בדם, גדלים הסיכונים להתפתחות 2 סיבוכי סוכרת קשים. מחלת הסוכרת נחלקת לשני סוגים עיקריים: סוכרת מסוג 1, המהווה כ- 10% מכלל מקרי הסוכרת, נגרמת כתוצאה מהרס אוטו-אימוני של תאי בטא בלבלב, אשר אחראיים על היצירה והפרשה של אינסולין. למחלה מרכיבים גנטיים וסביבתיים הגורמים להרס התאי-הבטא ומחסור באינסולין. חולים במחלה זו מייצרים מעט מאוד, או כלל אינם מפרישים אינסולין, וזקוקים להזרקת אינסולין באופן קבוע. לרוב, המחלה פורצת בתקופת הילדות או הבגרות, ולפיכך כונתה בעבר "סוכרת נעורים". סוכרת מסוג 2 הינה המחלה הנפוצה יותר ומהווה כ- 90% מכלל מקרי הסוכרת. זוהי מחלה מורכבת בעלת מרכיב גנטי המשולב בהשפעת גורמים סביבתיים. התפתחות המחלה מלווה בשינויים במטבוליזם של גלוקוז ושומנים עקב הופעת תנגודת היקפית לפעילות ההורמון אינסולין בשריר השלד, רקמת השומן והכבד, תוך כדי ירידה הדרגתית ברמות האינסולין שאינן 4,3 מספקות את צורכי הגוף. אינסולין, המופרש מתאי הבטא בתגובה לעלייה ברמות הגלוקוז, משמש כווסת העיקרי של שמירת ריכוזי הגלוקוז בדם. הורמון זה מתווך את פעולתו בשתי דרכים עיקריות; הראשונה היא עיכוב ייצור ושחרור של גלוקוז מהכבד והשנייה היא הגברת 5 קצב קליטת הגלוקוז ברקמות השומן ושרירי השלד. שינויים וחריגה מהתפקוד התקין של תאי הבטא הם בעלי חשיבות מכרעת בהתפתחות והתקדמות מחלת הסוכרת. במצב נורמלי, תאים אלו תורמים להומאוסטזיס של הגלוקוז ושומרים על רמתו בדם בתחום התקין. עם העלייה בדרישה לאינסולין עקב היצע מוגבר של גלוקוז או תנגודת היקפית, תאי הבטא מגדילים את כמות האינסולין המופרשת. אף על פי כן, גירוי ממושך של 8

תאים אלו עקב הדרישה המוגברת לאינסולין גורם בשלבי המחלה המתקדמים לפגיעה בתפקודם ולהחרפת המצב הסוכרתי. שילוב שני התהליכים גורם לתגובת שרשרת ולפגיעה נוספת בתאים, שמפרישים כמויות 6,4 הולכות וקטנות של אינסולין, תוך כדי עלייה בתמותת התאים בגלל תהליכי אפופטוזיס ונקרוזיס. התופעה הקלינית המשותפת לכל סוגי הסוכרת הינה ההיפרגליקמיה, עליה ברמות הגלוקוז הדם. מרבית סיבוכי המחלה המוקדמים והמאוחרים נובעים ישירות ממצב זה. בין הסיבוכים העיקריים ניתן למנות מחלות קרדיו- וסקולריות, ניורופתיה, מחלות כליות, רטינופתיה וסינדרום הרגל הסוכרתית. קצב הופעת הסיבוכים וחומרתם 8,7 עומד ביחס ישר למשך ולמידת ההיפרגליקמיה. הטיפול במחלת הסוכרת המטרה העיקרית בטיפול במחלת הסוכרת היא הורדת רמות הגלוקוז בדם. בתחילה חולי הסוכרת נדרשים לבצע שינויים באורח חייהם הכוללים תזונה נכונה עיסוק בפעילות גופנית והורדה במשקל. שינויים אלו הוכחו כיעילים לשמירה על רמות גלוקוז נורמליות בדם. אף על פי כן, מרבית החולים בסוכרת מסוג 2 נדרשים גם לטיפול תרופתי. כיום נמצאות בשימוש מספר קבוצות של תרופות אנטי-היפרגליקמיות המשמשות להורדת הגלוקוז בדם בחולי סוכרת מסוג 2 9,8. הקבוצה הנפוצה היא הסולפונילאוריאות. תרופות מקבוצה זו פועלות על הקולטן לסולפנילאוריאה בתאי בטא בלבלב, אשר מבקר את פעילות תעלות האשלגן תלויות K). ATP ) ATP קשירת התרופה לקולטן גורמת לסגירת תעלות האשלגן וכתוצאה מכך לדה-פולריזציה ופתיחת תעלות סידן תלויות מתח. העלייה בריכוזי הסידן התוך-תאיים מביאה וזיקולות אגירת של לשינוע האינסולין ואיחוי עם ממברנת התא ולבסוף.Meglitinides הגברה בהפרשת האינסולין. קבוצה נוספת היא משפחת ה- תרופות ממשפחה זו פועלות בדומה לסולפנילאוריאות אך בעלות אתר קישור שונה על גבי הקולטן. בעיותיהן המרכזיות של תרופות אלו Glucagon-like הן עלייה במשקל והיפוגליקמיה. קבוצת חדשה יחסית של תרופות הינה אנאלוגים של ומעכבי החלבון GLP-1 הינו הורמון אשר.(DPP-4) dipeptidyl peptidase 4 (GLP1) peptide 1 מופרש מהמעי בתגובה למעבר מזון בו. להורמון זה יש תפקיד חשוב בשחרור האינסולין בתאי הבטא 9

ובהפחתת שחרור גלוקגון מהלבלב בתגובה לגלוקוז. הורמון זה בעל זמן מחצית חיים קצר עקב פירוקו המהיר על ידי האנזים.DPP-4 לכן פותחו אנאלוגים ל- GLP-1 בעלי זמן מחצית חיים ארוך יותר, וכן מעכבים ל- DPP-4 אשר מונעים את פירוק ההורמון ומאריכים בכך את משך פעולתו האנדוגנית. קבוצה נוספת המיוצגת על ידי metformin התרופה היא ה-.biguanidins תרופה זו מגבירה את רגישות האינסולין ברקמות הפריפריות, מעכבת פירוק גליקוגן בכבד ואף מגבירה ישירות את קליטת הגלוקוז בתאי שריר שלד ורקמות שומן. אחת מתופעות הלוואי הנדירות, אך החמורות של תרופה זו היא חמצת של הדם. קבוצת תרופות נוספת,PPAR-γ הינה ה-.Thiazolidinedions תרופות הינן מקבוצה אגוניסטים ל את הרגישות ומגבירות לאינסולין בשרירי שלד ובנוסף מורידות את יצור הגלוקוז בכבד. ראוי לציין כי תרופות מקבוצה זו גרמו למספר חולים נזק בלתי הפיך בכבד. קבוצה נוספת היא מעכבים של האנזים.α-Glucosidase אנזים זה מפרק רב סוכרים במעי, ומעכבים שלו מקטינים את הסיכוי להיפרגליקמיה לאחר צריכת רב-סוכרים גבוהה, על ידי 9 האטת פירוקם במערכת העיכול. בשלבים מתקדמים יותר של המחלה, אשר מאופיינים ברמות אינסולין נמוכות עקב רגישות ותגובתיות ירודה של תאי הבטא לתנודות ברמות הגלוקוז בדם, לעיתים אין מנוס אלא לטפל באינסולין ממקור חיצוני גם בחולי סוכרת מסוג 2. הבעיות המרכזיות הכרוכות בטיפול באינסולין הינן מאורעות היפוגליקמיים 10 ומתן חודרני. בנקודה זו נשאלת השאלה- האם יש צורך בפיתוח של תרופות אנטי היפרגליקמיות חדשות לטיפול במחלה? והתשובה היא חיובית. בראש ובראשונה, לא קיימת כיום תרופה אשר מרפאת את המחלה, מונעת את התקדמותה או את הכשל בתאי בטא בלבלב. שנית, לחלק מהתרופות תופעות לוואי חמורות כגון היפוגליקמיה, חמצת לקטית, עלייה במשקל, בצקות ובעיות במערכת העיכול. בנוסף, רוב התרופות הופכות להיות פחות יעילות בטיפול ממושך וכרוני, ומרבית החולים יצטרכו טיפול משולב של מספר תרופות אנטי היפרגליקמיות על מנת לשמור על הערכים הגליקמיים 9 בדם. גורמים אלה מסבכים את הטיפול בסוכרת, ומפחיתים את היענות החולים. לכן קיים היום חיפוש אחר מטרות וטיפולים חדשים לפיתוח תרופתי. אחת המטרות 10

המעוררת עניין רב הינה Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase האנזים.)AMPK( האנזים AMPK כמטרה לפיתוח תרופתי האנזים AMPK הינו חיישן האנרגיה המרכזי בתא, ובעל תפקיד חשוב בשמירה על ההומאוסטאזיס המטבולי. זהו אנזים הטרומרי המורכב משלוש תת יחידות: תת יחידה קטליטית )α1 או α2( ושתי תת יחידות רגולטוריות )β1 או β2 ו- γ1 או γ2 או γ3(. הפעלת האנזים מתרחשת על ידי שלושה אותות עיקריים: מסלול LKB1 המופעל בעקבות עלייה ביחס AMP/ATP בתא, ומתווך על ידי האנזים )למשל בעת היפוקסיה או הרעבת גלוקוז(, השני המסלול מופעל בעקבות עלייה בריכוז יוני הסידן ומתווך על ידי האנזים (CaMKKβ) )למשל לאחר כיווץ שרירים ופעילות Ca 2+ /calmodulin-dependent kinase kinase β transforming growth factor-β-activated מסלול. נוסף המתווך על ידי הפעלת האנזים 11 גופנית(.(TAK1) kinase 1 הפעלת ה- AMPK גורמת לזרחון בעמדת Thr 172 של תת היחידה הקטליטית α. קשירה Thr 172 γ של AMP אל תת היחידה גורמת להפעלה אלוסטרית של האנזים,AMPK ולהגנה על מפירוק קשר הזרחן, כך שהאנזים נשמר במצבו הפעיל 12,4 )איור 1(. איור 1. האנזים AMPK 12 בצורתו המזורחנת. כאשר האנזים מופעל, הוא גורם להשפעות שונות ברקמות בעלות חשיבות מטבולית גבוהה. השפעות אלו כוללות בין היתר בקרה על מטבוליזם השומן, חלוקת וגדילת תאים והפחתת רמות הגלוקוז בדם )איור 2(. 11

כלומר, הפעלה של AMPK 13 מובילה לשליטה מטבולית טובה יותר. ממצאים אלו, יחד עם העובדה כי האנזים מופעל בשרירים בתגובה לפעילות גופנית, הביאו לעניין בפיתוח מפעילי AMPK כתרופות עתידיות עבור טיפול בסוכרת מסוג 2. איור 2. הפעלת האנזים AMPK 13 והשפעותיו ברקמות השונות. קליטת הגלוקוז בתאים המטבוליזם התאי של גלוקוז תלוי ביכולת המולקולה לחדור דרך הממברנה לתוך התאים. מולקולת הגלוקוז הינה הידרופילית, ולכן קליטתה לתאים אינה מתאפשרת בדיפוזיה פשוטה אלא מתווכת על ידי נשאי גלוקוז ייחודיים המאפשרים מעברה לתא. פעילות ומיקום חלק מנשאים אלו בתאים מבוקרים על ידי אינסולין ואף על ידי גלוקוז עצמו. )SGLT( קיימות שתי משפחות עיקריות של נשאי גלוקוז ממברנליים: נשאי הגלוקוז תלויי הנתרן אשר משתמשים במפל ריכוזי הנתרן ככוח מניע להכנסת מולקולות הגלוקוז לתאים. ידועים כיום שישה נשאים ממשפחה זו כאשר הנשאים העיקריים הם SGLT1 ו- SGLT2 אשר משמשים כקו-טרנספורטרים. נשאים אלה מצויים בעיקר באפיתל במערכת 15,14 העיכול ובנפרון שבכליות. קבוצת הנשאים השנייה היא ה- (GLUT( : פעולתם של נשאים אלו אינה תלויה בנתרן ופועלים בדיפוזיה מזורזת. Glucose Transporter 12

כיום מוכרים 13 נשאים ממשפחה זו בעלי הומולוגיה מבנית, אך נבדלים ביניהם באפיניות לסוכרים ובפיזורם ברקמות הגוף השונות. חמשת הנשאים העיקריים המאופיינים.GLUT1-5 ביותר בקבוצה זו הם הנשא הינו הנשא השכיח ברוב רקמות הגוף והאחראי לקליטת הגלוקוז הבסיסית בתאים. הנשא,GLUT2 GLUT1 המצוי בעיקר בתאי הבטא בלבלב, בתאי הכבד והכליה, חשוב למנגנון חישת הגלוקוז בתאי בטא וקליטה מהירה של הגלוקוז בכבד והפנייתו למסלולי אגירת אנרגיה. הנשא GLUT3 מצוי בעיקר בנוירונים ובעל אפיניות גבוהה לגלוקוז. הנשא GLUT4 מצוי ברקמות הרגישות לאינסולין, שריר הלב, השלד שרירי וברקמות השומן. עם חשיפת התאם לאינסולין, נשא זה מועבר במהירות לממברנת פני התאים. האינסולין מופרש מתאי בטא בלבלב בתגובה לעלייה ברמות הגלוקוז. לפיכך, זהו הנשא העיקרי האחראי על הורדת רמות הגלוקוז בדם לאחר הופעתו במחזור הדם. יש לציין כי פגמים ביכולת התאים הרגישים לאינסולין לגייס את נשאי ה- GLUT4 אל פני הממברנה תורמים להתפתחות היפרגליקמיה, ולכן נשא זה נחקר באופן יסודי במודלים סוכרתיים. GLUT5 הנשא ייחודי לקליטת פרוקוטוז, ומצוי בשכיחות גבוהה במעי הדק ובתאי הזרע. פעילותם התקינה של כל נשאי גלוקוז אלה 16,14 חשובה עבור שמירה על ההומאוסטאזיס של הגלוקוז. GLUT1 ממחקרים שונים GLUT4 כי הנשאים עולה ו- מצויים תחת בקרת גלוקוז בתאי יונקים שונים כגון תאי שריר שלד, תאי שריר חלק, 17 תאי שומן, ואנדותל בכלי דם. כאשר תאים אלה נחשפים לתנאים היפרגליקמיים, קטנה כמותם של נשאי גלוקוז בתא ושכיחותם על פני הממברנה הפלסמתית יורדת, ואילו במצבי היפוגליקמיה כמותם גדלה. מנגנון זה מאפשר וויסות קצב קליטת הגלוקוז בהתאמה לרמת הגלוקוז אליו התא נחשף. במצב הראשון מוגן תוך התא מפני שטף גלוקוז גבוה, העשוי לגרום ליצירת רדיקלים חופשיים, במצב השני מוגברת יכולת התא לקלוט גלוקוז. מסלולי האותות לגיוס הנשא GLUT4 אל פני הממברנה אינסולין ופעילות גופנית הם הגירויים העיקריים להגברת קליטת הגלוקוז בתאי שריר השלד. העברת הנשא מתוך התא אל פני הממברנה הפלסמתית בתגובה לאחד הגירויים האלה הינה תהליך רב שלבי, GLUT4 הגורם להעברה של וזיקולות עשירות ב- GLUT-4 אל פני שטח התא דרך השלד התוך תאי, ולבסוף עגינה 13

ואיחוי עם הממברנה. אינסולין ופעילות גופנית מביאים להגברת קצב קליטת הגלוקוז בתאי שריר השלד במנגנונים מולקולאריים נפרדים. גיוס הנשא GLUT4 על ידי האינסולין מתבצע במנגנון העברת אותות תוך תאי הכולל הפעלה של הקולטן לאינסולין וזרחון חלבוני,(IRS) Insulin receptor substrate ולאחר מכן (PI3K) הפעלה של Phosphatidylinositol 3-kinases המזרחן ומפעיל את החלבון המפתח.Akt/PKB GLUT4 בסוף המסלול AS160/TBC1D4 החלבון עובר זרחון ומבקר את תהליך ההעברה של אל פני הממברנת התא. פעילות גופנית וכיווץ שרירים מביאים להפעלת מסלול האותות של האנזים,AMPK וגם הוא גורם לבסוף לזרחון של החלבון AS160/TBC1D4 ו-,TBC1D1 וכתוצאה מכך העברה של GLUT4 לפני הממברנה )איור 3(. איור 3. מסלולי האותות לגיוס הנשא GLUT4 18 אל פני הממברנה הפלסמתית על ידי אינסולין או כיווץ שריר. 14

Rab-GTPase-activating ( Rab-GAP ו- TBC1D1 הם חלבונים מסוג AS160/TBC1D4 ועוברים זרחון במהלך מסלולי האותות של אינסולין או,AMPK אשר מביא אותם לצורתם )proteins הפחות פעילה. חלבונים אלו מעכבים את פעולת חלבוני ה- Rab )חלבונים המווסתים תנועת בין וזיקולות אורגנלות בתא( על ידי הגברת הידרוליזת ה- GTP שלהם. כדי ש - GLUT4 יוכל לנוע אל עבר הממברנה הפלסמתית כתוצאה מגירוי של אינסולין או הפעלת,AMPK החלבונים AS160/TBC1D4 ו - TBC1D1 צריכים לעבור זרחון והופכים פחות פעילים, וכך חלבוני ה- Rab עוברים 18 לצורתם הפעילה. מעניין לציין כי מוטציות בחלבון AS160 אשר מונעות את זרחונו, גורמות לירידה בקליטת הגלוקוז בשרירים בזמן כיווצם. 11 AMPK ונגזרותיו כמפעילי D-Xylose לפני מספר שנים נמצא במעבדתנו כי הפנטוז D-Xylose מגביר את קצב קליטת הגלוקוז בתאי שריר שלד GLUT4 בתנאים היפרגליקמיים במנגנון שאינו תלוי אינסולין, ומביא לגיוס נשאי אל פני ממברנת התא. הסוכר D-Xylose עצמו הוא בעל תכונות פרמקוקינטיים ופרמקודינאמיים השוללות את האפשרות שישמש כתרופה לטיפול בחולי סוכרת: ריכוזו הפעיל גבוה מדי,)20mM( זמן מחצית-החיים הביולוגי שלו קצר מאוד דקות( והיכולת להגביר את הכנסת הגלוקוז דועכת במהירות לאחר שטיפתו. לכן, בהמשך העבודה 30-60( סונתזו נגזרות D-Xylose חדשות בעלות פרמטרים פרמקודינמיים ופרמקוקינטיים משופרים, המתאימים לטיפול תרופתי. הוכנו מספר נגזרות בעלות potency ו efficacy משופרים, אשר העלו את קצב קליטת הגלוקוז בתאי שריר שלד דרך גיוס נשאי GLUT4 לממברנות התאים ובכך הגבירו את קצב קליטת הגלוקוז (2,4;3,5-Di-O-benzylidene-D-Xylose- בתאים. הנגזרות הפעילות ביותר שסונתזו הן EH-36 (2,4-O-benzylidene-D-xylose-diethyl-dithioacetal) EH-40 ו- Diethyl-Dithioacetal) )איור 4(. בניסויים in-vivo במודל עכברים סוכרתיים הוריד החומר EH-36 את רמות הגלוקוז בדם באופן משמעותי. תוצאות בתרביות תאים העידו כי מנגנון הפעולה של חומרים אלה מערב את הפעלת האנזים 15

.AMPK יחד עם זאת, נדרש שיפור נוסף בתכונות החומרים כיוון שזמן ההגעה עד להשפעה המקסימלית של EH-36 היה ארוך hr) 18) וריכוז אפקטיבי של 10 µm והריכוז האפקטיבי של EH-40 היה מעל 150 20,19. µm EH-36 EH-40 איור 4. הפנטוז D-Xylose 19 כמולקולת אב-טיפוס עבור הנגזרות החדשות. נגזרות Ethoxybenzo-thiazol בהמשך של עבודה זו )שאותה ביצענו בשיתוף פעולה עם מעבדתו של דר' אריה גרוזמן באוניברסיטת בר- אחר חיפשנו אילן(, חומרים פוטנטיים ויעילים יותר מנגזרות הקסילוז לכן האלה. תכננו, סינתזנו וסרקנו 2-chloro-5- סדרה חדשה של חומרים אשר התבססה על אנליזת מבנה-פעילות של מפעיל AMPK ידוע: ((Z)-((E)-5-((5-(4,5-dimethyl-2-nitrophenyl)furan-2-yl)methylene)-4-oxothiazolidin-2-16

בספרות (PT1).ylidene)amino) benzoic acid דווח כי מולקולה זו, שנגזרה מהחומר AMPK מפעילה באופן ישיר את,Furanothiazolidine על ידי אנטגוניזם לקונפורמציה האוטו- אינהיביטורית של תת היחידה הקטליטית היחידה הקטליטית באנזים 21. α המולקולה PT1 גורמת לזרחון של אך אינה מגבירה את קצב הכנסת הגלוקוז בתאי שריר השלד L6.,AMPK PT1 בתהליך פיתוח סדרת החומרים החדשה התמקדנו בקביעת המבנה הפעיל המינימלי של אשר יכול להגביר את הזרחון של.AMPK המטרה הסופית הייתה פיתוח של סידרת חומרים יעילים יותר להפעלת האנזים AMPK וכתוצאה מכך להגברת קצב כניסת גלוקוז לתאי שריר שלד. לשם כך, סונתזו במעבדה מספר נגזרות חלקיות של,PT1 אך גם הן לא גרמו לעלייה בקצב קליטת הגלוקוז. בהמשך הפרויקט סונתזו נגזרות ממגוון המוטיבים במבנה של,PT1 וזוהו קבוצות פונקציונליות, כאשר קבוצת ה - ethoxybenzo-thiazol )איור 5( נמצאה כהכרחית להפעלת האנזים AMPK ולהגברת קצב קליטת גלוקוז לתאי שריר שלד. לפיכך, סונתזה סידרה חדשה של,ethoxybenzo-thiazol נגזרות מהמוטיב ומספר נגזרות משופרות של החומר EH-36 ועל חומרים אלו מבוססת עבודה זו. איור 5. מבנה מפעיל ה- AMPK, PT1 ונגזרותיו ומבנה קבוצת ה-.ethoxybenzo-thiazol 17

מטרות העבודה: מטרת העבודה הנוכחית הייתה לסרוק את ethoxybenzo-thiazol פעילות נגזרות ה- החדשות ומתוכן לבחור את החומר היעיל והפוטנטי ביותר. בהמשך, לחקור את השפעותיו של החומר בתאי שריר שלד ולאפיין את מנגנון פעולתו של החומר בתאי שריר השלד. כיום יש עניין בפיתוח תרופות שיפעלו בכמה אתרי מטרה, ועל כן המטרה הנוספת הייתה לבדוק האם החומר המוביל עשוי גם להגביר את הפרשת האינסולין בתאי הבטא בלבלב, ולאפיין את מנגנון הפעולה גם באתר מטרה זה. השערת המחקר של עבודתי היא שנגזרות ה- ethoxybenzo-thiazol החדשות יגבירו את קצב קליטת הגלוקוז בתאי שריר השלד בריכוזים אפקטיביים נמוכים ולאורך זמן ובנוסף ישפיעו על הפרשת האינסולין מתאי הבטא. הקו המנחה הוא שפיתוח חומר ייחודי המתמקד בשתי מטרות מרכזיות בטיפול בסוכרת מסוג 2 יכול להוות טיפול בעל ערך מוסף במחלה זו. מחקר זה הינו חלק מפרויקט נרחב שבו מפותחות סדרות של חומרים חדשניים בהתבסס על אנליזות מבנה-פעילות יהוו אשר בסיס לפיתוח תרופתי חדש. במסגרת עבודתי חקרתי את האפקטים ומנגנון הפעולה של חומרים מבטיחים שפותחו במהלך פרויקט זה, כאשר היעדים הספציפיים של עבודת מחקר זו הם: בחינת השפעותיהם של נגזרות ethoxybenzo-thiazol החדשות על קצב כניסת הגלוקוז בתרביות תאי שריר השלד L6 וחיות התאים. בדיקת השפעות של החומר המוביל בתאי בטא מפרישי אינסולין במודל in-vitro של תרביות תאי INS-1E על הפרשת אינסולין וחיות התאים. חקר מנגנון הפעולה של החומר המוביל בתרביות תאי שריר שלד ובתאי בטא. מטרות ארוכות טווח של מחקר זה הינן: חקירת פעילותו של החומר המוביל ברקמות מטרה נוספות. חקירה עתידית בנוגע למעורבות חלבונים נוספים במנגנון הפעולה התוך תאי של חומר זה. פעילות החומר במודל.in-vivo 18

חומרים ושיטות: רשימת חומרים α-mem, RPMI 1640, FBS, SDS 10%, L-glutamine solution, Penicillin / Streptomycin solution, Sodium Pyruvate, Trypsin-EDTA, Acrylamide/bis-acrylamide 40% solution, HEPES, PBS, EZ-ECL kit (Biological Industries, Beth-Haemek, Israel). BSA, D(+)Glucose anhydrous, protease inhibitor cocktail, glycine, DMSO, PMSF, TEMED, 2-Mercaptoethanol, Trizma base, 2-Deoxy-D-glucose, Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (Sigma-Aldrich, Israel). Methanol, Tween 20 (J.T.Baker,Philisburg NJ, USA) Horseradish peroxidase-conjugated anti- rabbit, anti-mouse- IgG antibodies, Goat-anti rabbit (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Anti-AMPKα and anti-pthr 172 -AMPKα antibodies (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Anti-Akt and anti-pser 473 -Akt antibodies (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Anti c-myc antibodies (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). 2-[1,2-3 H(N)]Deoxy-D-glucose (1.48 TBq/mmol) (American Radiolabeled Chemicals, St. Louis, MO). Rat/Human Insulin radioimmunoassay kit (Linco Research, St.Charles, MO). Bradford reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). 19

שיטות גידול שורת תאי מיוציטים מחולדה )L6( שורת התאים L6 הינה בעלת מספר תכונות תאיות ופיזיולוגיות של רקמת שריר שלד, והיא מייצגת מודל טוב ומקובל לחקירת פעילות תאי שריר שלד. שיטת הגידול מבוססת 19 על פי המתואר בספרות. בקצרה, α-mem CO 2 התאים גודלו באינקובטור ב- 37ºC תחת air/5% 95%. מדיום הגידול היה שמכיל 5.5mM גלוקוז, 1% פניצילין, 1% סטרפטומיצין, 1% גלוטמין, 2% סרום עובר פרה ו- 5.5mM גלוקוז. התאים נזרעו בצלחות תרבית וכאשר הם מגיעים לצפיפות גבוהה הם מתמיינים באופן ספונטני לסיבי שריר שלד רב- גרעיניים. בסיבים אלו נבדק קצב קליטת הגלוקוז בחשיפה לחומרים השונים. מדיום הגידול הוחלף אחת ליומיים. גידול שורת תאי אינסולינומה מחולדה (INS-1E) שורת התאים INS-1E מהווה מודל יציב ואמין לתאי בטא, כיוון שהם מפרישים אינסולין בתגובה לטווח.95% air/5% CO 2 מדיום הריכוזים 22 הפיזיולוגי של גלוקוז.התאים גודלו באינקובטור ב- 37ºC תחת 1% פניצילין, 1% סטרפטומיצין, 1% גלוטמין, 1% 11mM הגידול היה RPMI 1640 שמכיל גלוקוז,,2-mercaptoethanol 10% סרום עובר פרה, אשר עבר 50 µm סודיום פירובאט, 1 mm,hepes איבטול ב- 56 C למשך חצי שעה. מדיום הגידול הוחלף אחת ליומיים. התאים שומשו לניסויים בדורות -60 90 בהם הפרשת האינסולין בתגובה לגלוקוז ידועה כאופטימלית. קביעת קצב קליטת הגלוקוז בתאי שריר שלד חשיפת סיבי שריר השלד לחומרים הסינטטיים ובדיקת ההשפעה על קצב קליטת הגלוקוז לעומת קצב קליטת הגלוקוז בתאי הביקורת. שיטה זו מבוססת על מעקב אחר קצב קליטת אנלוג הגלוקוז H]-2-deoxy-D- [ 3.glucose בדומה לגלוקוז, סוכר זה נקלט בתאים על ידי נשא הגלוקוז, ובהמשך עובר זרחון על ידי האנזים 20

,hexokinase אך בניגוד לגלוקוז, האנלוג המזורחן אינו עובר מטבוליזם נוסף ונותר לכוד בתוך התא. המעקב התבצע על תרביות תאים שנשטפו 3 פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הודגרו למשך 5 דקות 10 µm [ 3 H]-2-deoxy-D-glucose 1µCi/ml שהכילה )250 µl( בתמיסת PBS מאנלוג הגלוקוז וכן ממנו בצורתו הבלתי מסומנת. קליטת אנלוג הגלוקוז הופסקה על ידי 2 שטיפות מהירות ב- PBS המכיל 20 mm גלוקוז קר )4 C(, ולאחריהן שטיפה מהירה ב- PBS קר ללא תוספות. בהמשך התאים הומסו בתמיסת 0.1M, NaOH עורבבו עם נוזל סנטילציה ונלקחו לקביעת עוצמת הקרינה הרדיואקטיבית שנותרת בתאים. 23 במונה נצנץ Counter( (Scintillation קביעה קולורימטרית של כמויות GLUT4myc בממברנה הפלסמתית 41 c-myc L6 שיטה זו מבוססת על שימוש בתאי אשר מבטאים באופן יציב את האפיטופ )המורכב מ- חומצות אמינו( בלולאה הראשונה החוץ תאית של נשא הגלוקוז.GLUT4 התאים נשטפו בבופר PBS קר )1 C(, ובוצעה חסימת אתרי הקישור הבלתי ספציפיים לנוגדן באמצעות חשיפתם לתמיסת PBS בתוספת Anti-myc Polyclonal.1 C ב דק' למשך 41 בהמשך, התאים הודגרו עם )5% v/v( goat serum 1 C. לצורך קביעת בתמיסת PBS בתוספת )5% v/v( goat serum למשך שעה ב )40411( antibody )5% v/v( goat serum בליעת הרקע הודגרו תאים בתמיסת PBS בתוספת ללא נוגדן ראשוני. התאים )4% w/v( paraformaldehyde (PFA) נשטפו 5 פעמים בתמיסת PBS ב- 1 C, והועברו פיקסציה ב- 7.5gr/L, w/v (.1 C שהומס בתמיסת PBS ב דק' ל- 41 לאחר מכן, הודגרו התאים בבופר גליצין.1 C PBS 3 paraformaldehyde ב )PBS שיירי לנטרול ונשטפו פעמים בבופר ב התאים Glycine )5% v/v( goat serum בתוספת PBS )404,111( הודגרו עם נוגדן שניוני, goat anti rabbit בתמיסת 404,111 למשך 15 דק' ב 1 C. התאים נשטפו 6 פעמים בבופר PBS ב- 1 C, והודגרו עם 1ml ריאגנט O-,pPhenylenediamine (OPD) אשר הוכן בבופר פוספאט-ציטראט,50 ml ו- 20 μl מי חמצן 30% 15-30,20 mg OPD לטבלייה ביחס אחת של לפי הוראות היצרן, למשך הריאקציה נעצרה דק'. Elisa Reader ונלקחו לקריאה ב 66-well בהוספת 250 μl של.3M HCl הדוגמאות הועברו לפלטת 21

באורך גל 164 nm בכדי להעריך את הכמות היחסית של GLUT4myc על הממברנה הפלסמתית של סיבי שריר השלד. מבחן הפרשת אינסולין התלויה בגלוקוז שיטה זו מאפשרת לקבוע את כמויות האינסולין שהופרשו בתגובה לגלוקוז ולחומרים שנבדקו. לפני הניסוי Krebs-Ringer 37 C תאי INS-1E נשטפו פעם אחת והודגרו למשך שעה בטמפ' בבופר,5 mm NaHCO 3,4.75 mm KCl,135 mm NaCl בהרכב הבא: bicarbonate/hepes (KRBH).pH 7.4 לתמיסה זו,10 mm HEPES,1.2 mm CaCl 2,1.2 mm MgSO 4,1.2 mm KH 2 PO 4 3.3 mm - כנשא של האינסולין, ו )0.5% w/v( גלוקוז. בסיום ההדגרה המקדימה, התאים הוספו BSA הודגרו בבופר KRBH המכיל 3.3 mm גלוקוז למשך שעה, ולאחר מכן לשעה נוספת בבופר דומה המכיל גלוקוז בטמפ' 37 C. בסוף שתי ההדגרות הבופר נאסף ושימש לקביעת רמות האיסולין בו. 16.7 mm 0.2 תכולת האינסולין בתאים נקבעה על ידי מיצוי התאים עם בופר GB/NP-40 בהרכב הבא: גליצין (.ph=8.8,)0.5% v/v( NP-40,)0.5% w/v( BSA,)mM הפרשת האינסולין ותכולת האינסולין בתאים נקבעו באמצעות שיטת AIR ספציפית לאינסולין, המבוססת על ריאקציית אנטיגן-נוגדן, שבה כמויות קטנות )Linco Research Inc, St.Charles, MO, USA( של אינסולין מסומן ביוד רדיואקטיבי I 125 insulin מתחרות עם האינסולין שהופרש מתאי הבטא על כמות מוגבלת של אתרי קישור לנוגדן לאינסולין, כמתואר בספרות 22, ועל פי הוראות היצרן. MTT Assay שיטה זו מאפשרת בדיקת חיות התאים. החומר (MTT) Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium הינו בעל צבע צהוב. כאשר הוא עובר חיזור על ידי אנזימים מיטוכונדריאליים, אשר פעילים bromide בתאים חיים בלבד,הוא הופך ל- MTT formazan אשר צבעו סגול. התאים הודגרו עם החומרים למשך פרק הזמן הרצוי ובסיום המדיום נשאב מהבאריות והוחלף במדיום טרי. התאים הודגרו עם 50 µl של תמיסת 22

למשך 20-30 לצורך דק'. קביעת בליעת הרקע, הודגרו תאים עם מדיום ללא (5mg/ml PBS) MTT 96-well הדוגמאות הועברו לפלטת.DMSO של 1ml הריאקציה נעצרה ע"י שאיבת הנוזל והוספת.MTT ונלקחו לקריאה ב- ELISA reader באורך גל של 570nm והתוצאות כומתו לקביעת חיות התאים. הכנת תמציות תאים וקביעת כמות חלבון PBS - תרביות התאים טופלו כמצויין ולאחר מכן נשטפו שלוש פעמים ב קר )4 C( והוסף בופר המכיל: 50mM Tris ph 7.5, 150mM NaCl, (1%v/v) NP-40, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1mM Na 3 VO 4, 50mM NaF, 10mM Na-β-glycerophosphate, 10mM Na-pyrophosphate, (1%v/v).2-β-ME, 1mM PMSF, protease inhibitor cocktail 1:100, H 2 O בופר זה מכיל מעכבי פרוטאזות ופוספאטזות, ושימש גם להפקת חלבונים מזורחנים. התאים טולטלו בעדינות במשך 30 דקות בנוכחות הבופר ובהמשך נאספו במבחנות וסורכזו בקור במשך 15 דקות ב- 15400. xg הנוזל עליון הופרד מהמשקע ונלקח 595 nm לקביעת חלבון בעזרת ריאגנט,Bradford באורך גל של על סמך עקומת כיול שהוכנה עם החלבון.BSA אנליזת Western Blot השיטה שימשה לצורך קביעת רמות הביטוי של החלבונים Akt,Thr 172 -AMPKα,AMPKα,α-tubulin ו-.Ser 473 -Akt מתמציות התאים שהוכנו כמפורט לעל נלקחו 15-50 µg ועורבבו עם בופר הטענה שהרכבו: 6.8) )0.1% w/v( bromophenol blue,)0.2%( glycerol,)20% v/v( SDS,125 mm Tris (ph ו-.95ºC והורתחו 5 במשך ב- דקות נלקחו מכן לאחר הדוגמאות ידי על להרצה 100 mm DTT nitrocellulose.)10%( אלקטרופופרזה בג'ל אקרילאמיד ההרצה בתום הועברו החלבונים לממברנות במערכת העברה חשמלית למשך שעה וחצי ב- 400mA. בסיום שלב זה, בוצעה חסימת אתרי הקישור הבלתי,Tween-20 (0.1% v/v( TBS-T ספציפיים הממברנה גבי על לנוגדן באמצעות חשיפתה לתמיסת בתוספת למשך w/v( 5%( שעה בטמפרטורת BSA 0.02M Tris (ph 8(,0.015M NaCl 0.015 M 23

החדר. בהמשך הממברנה הודגרה במשך לילה שלם ב- 4ºC בנוכחות נוגדן ראשוני מהול בתמיסת TBS-T anti-pthr 172- AMPKα,)1/1,000( anti- AMPKα,)1/30,000( בהתאם 0 anti-α-tubulin הממברנה שלוש מכן לאחר נשטפה.(1/1,000) anti-pser 473 -Akt,(1/1,000) anti-akt,)1/1,000( (1/4,000( goat anti-rabbit TBS-T בתמיסת דקות במשך פעמים 5 מתאים שניוני נוגדן עם והודגרה בתמיסת TBS-T במשך שעה בטמפרטורת החדר. תגובת הנוגדן או (1/30,000) goat anti-mouse מהול TBS-T השניוני שטיפות ידי על הופסקה הממברנה של נוספות עם תמיסת )שלוש פעמים, 5 זיהוי דקות(. enhanced החלבונים הדגרת ידי על התאפשר ה- עקרון בסיס על הפועל מסחרי ריאגנט עם הממברנה )ECL( chemiluminescence בהתאם להוראות היצרן. מבחנים סטטיסטיים.)Mean± SEM( הניסויים בוצעו בחזרות של n 3 והתוצאות הגרפיות מוצגות כממוצע סטיית תקן. ההבדלים הסטטיסטיים חושבו בעזרת מבחן t לא מזווג, דו זנבי, 5 24

תוצאות: השפעת החומרים על קצב קליטת הגלוקוז בתאי שריר שלד בעבודה שנעשתה בעבר במעבדתנו פותחה סידרה של חומרים אשר הגבירה את קצב כניסת גלוקוז לתאי שריר שלד, במנגנון שאינו תלוי 19 באינסולין, על ידי הפעלת האנזים. AMPK בהתבסס על עבודה זו פותחה סידרה חדשה של חומרים שעברו סריקה על מנת לאתר מולקולות פוטנציאליות להמשך מחקר ופיתוח. ethoxybenzo- בחיפוש אחר חומרים אשר מבקרים את קליטת הגלוקוז לשרירי 25 שלד, בדקנו נגזרות thiazol חדשות )קבוצת ה- )EMMs ו- 8 נגזרות משופרות של החומר EH-36 )קבוצת ה- )NGs בתרביות 1. המבנה תאי L6 של סיבי שריר. עבור כל חומר בוצע ניסוי תלוי מנה וזמן, והתוצאות מסוכמות בטבלה המלא של כל החומרים החדשים מופיע בפרק נספחים. רוב החומרים אשר נבדקו השפיעו במידה זו או אחרת על הגברת קצב כניסת הגלוקוז לתאי שריר השלד, אם כי במידה שונה. מתוך הנגזרות השונות, נבחרו שלושה (6- EMM-33,(1,2-bis(6-ethoxybenzo[d]thiazol-2-yl)disulfane) חומרים: EMM-5 (2-(propylthio)benzo[d]thiazol-6-ol) EMM-45 ו- ethoxybenzo [d]thiazole-2-sulfonamide) שהראו את יכולת הגברת קליטת הגלוקוז והם שימשו ביותר הטובה לניסויים נוספים, כאשר לבסוף נבחר החומר EMM-45 אשר הראה את הפעילות הפוטנטית והיעילה ביותר להמשך חקירה ואפיון. מניסויי מנה-תגובה )איור 6( ניתן לראות כי שלושת החומרים הגבירו את קצב כניסת הגלוקוז לסיבי השריר של תאי L6 באופן תלוי מנה. החומרים EMM-5 ו- EMM-33 אמנם העלו את קצב קליטת הגלוקוז פי 3.2 ו- 3 בהתאמה, לעומת EMM-45 אשר העלה פי 2.5 את הקצב, אך שני החומרים הראשונים הגיעו EMM-45 150 µm ו- 100 µm לשיא הפעילות בריכוזים גבוהים של בהתאמה, החומר ואילו הגיע לפעילות מירבית כבר בריכוז של 37.5. µm 25

Substance Name Potency (EC 50 ) EC max Fold effect Time of exposure EMM 45 17 μm 50 μm X2.5 5H EMM 5 39 μm 100 μm X3.2 4H EMM 33 75 μm 150 μm X3 5H EMM 57 50 μm 150 μm X1.5 5H EMM 131 4 μm 10 μm X1.45 24H EMM 43 75 μm 150 μm X1.45 16H EMM 7 12 μm 25 μm X1.35 5H EMM 11 17 μm 25 μm X1.35 5H EMM 53 3 μm 5 μm X1.35 5H EMM 51 40 μm 100 μm X1.35 5H EMM 71 60 μm 100 μm X1.30 5H EMM 29 65 μm 75 μm X1.2 5H EMM 108 30 μm 50 μm X1.2 5H EMM 130 50 μm 75 μm X1.2 5H EMM 61 40 μm 100 μm X1.2 16H EMM 55 3 μm 5 μm X1.15 5H EMM 49 12 μm 25 μm X1.15 10H EMM 91, 93,80,109 Negligible effect - - - EMM 31,59, 69,116 No effect - - - NG 80 18 µm 40 µm X1.75 5H NG 86 10 µm 25 µm X1.5 5H NG 37 120 μm 150 μm X1.4 10H NG 90 5 µm 25 µm X1.25 5H NG 38 5 μm 25 μm X1.2 5H NG 6,70, 82 No Effect - - - טבלה 1. השפעותיהן של 25 נגזרות ה- ethoxybenzo-thiazol על קצב כניסת הגלוקוז לתאים. התרביות הודגרו במדיום שהוסף לו גלוקוז בריכוז 25 mm למשך 24 שעות ובנוכחות הנגזרות השונות לפרקי זמן של 5-24 שעות. בטבלה מוצגים- מידת הפוטנטיות של כל אחד מהחומרים, הריכוז והזמן בו החומר הגיע להשפעה המירבית שלו, ופי כמה העלה החומר את קצב כניסת הגלוקוז לתאים לעומת תאי בקרה אשר הודגרו עם הממס DMSO למשך אותו הזמן. בתום ההדגרה התאים נשטפו 3 פעמים עם (3=n) [ וקצב קליטתו נקבע כמפורט בפרק השיטות. 3 H]-2dGlc בטמפ' החדר והודגרו עם האנאלוג PBS 26

dglc Uptake pmol/mg protein/min dglc Uptake pmol/mg protein/min A B 12 10 12 10 8 6 4 8 6 4 2 2 0 0 25 50 75 100 125 150 EMM 5 (μm) 0 0 25 50 75 100 125 150 EMM 33 (μm) C 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 EMM 45 (μm) איור 6. הגברת קצב כניסת הגלוקוז בהשפעת החומרים EMM-5 EMM-33 ו-.EMM-45 בדיקת השפעת החומר EMM-5 (A), (B) EMM-33 ו- EMM-45 (C) בתלות במנה. תרביות התאים נשטפו והדגרו במדיום טרי שהוסף לו גלוקוז בריכוז 25 mm למשך 24 שעות וריכוזים עולים של החומרים hr) 5). בתום ההדגרה התאים נשטפו עם PBS בטמפרטורת החדר והודגרו עם אנלוג הגלוקוז [ 3 H]-2dGlc וקצב קליטתו נקבע כמפורט בפרק השיטות. )3=n 0.05>p(,() 27

dglc Uptake pmol/mg protein/min EMM-45 בהמשך, נבחנה השפעתו של קליטת הגלוקוז קצב על באופן תלוי זמן. ההשפעה המירבית התקבלה כעבור 5 שעות, ונשמרה לאורך 24 שעות )איור 7(. 22 20 18 16 14 12 25uM 10 37.5uM 8 Vehicle 6 4 2 0 0 5 10 15 20 25 Time (hr) איור 7. השפעת החומר EMM-45 על הגברת קצב כניסת גלוקוז בתאי שריר שלד L6. בדיקת השפעת EMM-45 בתלות בזמן. תרבית התאים נשטפה והודגרה במדיום טרי שהוסף לו גלוקוז בריכוז 25, mm ו- EMM-45 בריכוזים 25 µm ו- 37.5.µM בנוסף, תרביות הבקרה נחשפו למשך אותו זמן לממס.DMSO בתום ההדגרה למשך פרקי הזמן הנקובים התאים נשטפו עם 0.05>p),() [ וקצב קליטתו נקבע כמפורט בפרק השיטות. 3 H]-2dGlc בטמפרטורת החדר והודגרו עם אנלוג הגלוקוז PBS.n=3) החומר EMM-45 לא גרם לתמותת התאים כפי שנקבע בשיטת ה-.MTT תוצאה זו התקבלה גם עם שימוש בריכוז הפעיל של EMM-45 37.5). µm) רק בשימוש בריכוזים גבוהים יותר של החומר, שלא שימשו לקביעת קצב קליטת הגלוקוז, נצפתה תמותת תאים )איור 8(. 28

איור 8. קביעת השפעתו של EMM-45 על תמותת תאי שריר שלד. תאי ה- L6 הודגרו עם החומר EMM-45 בטווח ריכוזים של 5-75µM למשך 24 שעות ו - 48 שעות. לאחר ההדגרה נמדדה רעילות )ציטוטוקסיות( החומר באמצעות שיטת ה-,MTT כפי שפורט בפרק השיטות. (3=n 0.05>p).,() מנגנון הפעולה של EMM-45 בשרירי שלד כאשר בוחנים את פעולתם של אינסולין והחומר המוביל EMM-45 בשרירי שלד, נמצא המכנה המשותף בפעולתם: הגברת קצב קליטת הגלוקוז בתאים אלו. אך המאפיינים של התכונות להגברת קצב כניסת הגלוקוז של האינסולין שונים מאוד משל החומר.EMM-45 האינסולין פועל בתוך מספר דקות וההשפעתו נעלמת זמן קצר לאחר החשיפה אליו. בניגוד לכך, זמן תחילת הפעילות של EMM-45 הוא תוך חצי שעה מהחשיפה אליו והשפעתו נמשכת לאורך זמן רב. לכן ניתן להניח כי מנגנון הפעולה של EMM-45 עשוי להיות שונה מזה של אינסולין. 29

ידוע כי בנוסף, האינסולין מגביר את קצב קליטת הגלוקוז בתאי שריר שלד על ידי גיוס של נשאי הגלוקוז GLUT4 ממאגרים תוך-תאיים אל פני הממברנה הפלסמתית. בכדי לבחון באיזה אופן מגביר החומר EMM-45 את קצב קליטת הגלוקוז בתאים אלו, בדקנו האם גם הוא מגביר את כמות נשאי ה- GLUT4 על גבי הממברנה הפלסמתית. לשם כך נעשה שימוש בתאי L6 אשר מבטאים באופן יציב את האפיטופ c-myc בעל 14 חומצות אמינו בלולאה הראשונה החוץ-תאית של הנשא,GLUT4 ובאמצעות שיטה קולורימטרית ניתן היה לקבוע את כמות הנשא לגלוקוז שגויס אל פני הממברנה הפלסמתית. איור 9 מתאר ניסוי בו נחשפו תאי L6 המבטאים את האפיטופ c-myc למדיום עם ריכוז גלוקוז גבוה mm) 25) למשך 24 שעות יחד עם החומר EMM-45 בריכוז.37.5µM חלק מהתאים נחשפו במהלך ה- דקות האחרונות גם לאינסולין nm) 250). ניתן לראות כי האינסולין הגביר את יעילות גיוס הנשא 20 GLUT4myc פי 1.6. החומר EMM-45 הגביר אף הוא את נוכחות הנשא על פני הממברנה באופן דומה. כמו כן, ניתן לראות כי בחשיפה של התאים לשני החומרים יחדיו- אינסולין ו-,EMM-45 התקבלה השפעה מסכמת )אדיטיבית( ויעילות גיוס הנשא עלתה פי 2.4. ממצא זה מרמז על קיום מסלול אותות תוך תאי שונה של החומר EMM-45 לעומת מסלולו של האינסולין. על מנת לבדוק האם החומר EMM-45 מפעיל את האנזים AMPK בוצעה אנליזת Western Blot תוך שימוש בנוגדן הספציפי לתת היחידה α של האנזים AMPK אשר עוברת זרחון בעמדת.Thr 172 כבקרה חיובית בניסוי נעשה שימוש במפעיל ידוע של - AMPK שוק היפראוסמולרי )על ידי חשיפת תרבית התאים לריכוז גבוה של סורביטול(, זהו מצב עקה בו מאגרי ה- ATP מתרוקנים, תכולת ה- AMP בתאים עולה, ולפיכך AMPK 24 מופעל. באיור 10 ניתן לראות שכמצופה, השוק ההיפראוסמולרי הביא לזרחון משמעותי,Thr 172 EMM-45 של השייר Thr 172 באנזים AMPKα בסיבי שריר שלד. גם החומר הביא לזרחון של.)11 השפעת EMM-45 כאשר תכולת התא הכללית של AMPKα לא השתנתה בנוכחות החומרים )איור 24 10 החלה תוך זמן קצר של מרגע החשיפה דקות ונמשך לאורך זמן של שעות. לפיכך, הפעלת האנזים AMPKα קודמת להגברה המירבית של כניסת גלוקוז לתאי שריר שלד. 30

Relative Density (percent of control) Plasma Membrane GLUT4myc (Percent of control) 300 250 200 150 100 50 0 Vehicle EMM 45 37.5µM EMM 45 37.5µM +Insulin S/F Insulin איור EMM-45 9. הגביר את כמות הנשאים לגלוקוז בממברנה הפלסמתית של תרביות סיבי השריר L6. סיבי שריר L6 המבטאים GLUT4myc באופן קבוע נשטפו והודגרו עם מדיום טרי שהוסף לו גלוקוז בריכוז,25mM ו EMM-45 בריכוז DMSO( או רק את טיפול הבקרה,)S/F( למשך 20 דקות במדיום ללא סרום 250 nm למשך 5 שעות, ו/או אינסולין 37.5µM או,S/F בהתאמה(. בסיום ההדגרה נלקחו התאים לזיהוי ה- GLUT4myc שבממברנה באמצעות נוגדן, כפי שתואר בפרק השיטות. n=4(.)p<0.05 (), pthr 172 -AMPKα Total AMPK-α Tubulin 250 200 150 100 50 0 Vehicle Sorbitol 0.25M איור EMM-45 11. מפעיל את האנזים AMPK באופן תלוי-זמן. סיבי שריר השלד נחשפו לריכוז גלוקוז גבוה mm( 25( במשך 24 שעות. לאחר מכן, חלק מהתאים נחשפו לחומר EMM-45 37.5( µm( בטווח זמנים בין 10 דקות ל 24 שעות, וחלק מהתאים נחשפו למפעיל ידוע של האנזים :AMPK שוק היפראוסמולרי min( 0.25( M sorbitol, 30 כבקרה חיובית. תרביות.)p<0.05 (), n=3( western-blot Vehicle 10min 25min 45min 1.5hr 3hr 6hr 12hr 24hr התאים נקצרו, החלבונים הופרדו באלקטרופורזה והתוצאות נותחו באמצעות שיטת 31

Total AMPK/ Tubulin (Percent of control) N.S. 120 100 80 60 40 20 0 Vehicle Sorbitol Vehicle 10min 25min 45min 1.5hr 3hr 6hr 12hr 24hr 0.25M איור 11. הכמות היחסית של החלבון AMPK נשמרת לאחר טיפול בתאי L6 עם EMM-45 בכדי לשלול את האפשרות כי EMM-45 פועל גם דרך מסלול תלוי אינסולין, אנליזת בוצעה.Ser 473 Akt החלבון זרחון לזיהוי נוספת בעמדת כבקרה חיובית הדגרה עם התבצעה Western Blot אינסולין למשך 20 דקות במדיום ללא סרום.(SF) באיור 12 ניתן להתרשם כי החומר EMM-45 אינו גורם להפעלת החלבון Akt לאורך זמן, וכי הדגרה עם אינסולין גרמה להפעלה שלו. כמו כן, תכולת החלבון הכללית לא השתנתה באופן משמעותי בנוכחות החומרים )איור 13(. 32

Total AKT /Tubulin (Percent of control) Relative Density (percent of control) pser 473 -Akt Total Akt Tubulin 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Vehicle 10 min 25 min 1.5 H 3H 6H 12H 24H SF Insulin איור 12. החומר EMM-45 אינו פועל דרך מסלול העברת האותות תלוי אינסולין. סיבי שריר השלד נחשפו לריכוז גלוקוז גבוה mm( 25( במשך 24 שעות. לאחר מכן, חלק מהתאים נחשפו לחומר EMM-45 37.5( µm( בטווח זמנים בין 10 דקות ל- 24 שעות, או אינסולין 250 nm למשך 20 דקות במדיום ללא סרום )SF( כבקרה חיובית. תרביות התאים נקצרו, החלבונים הופרדו על ידי אלקטרופורזה והתוצאות נותחו באמצעות שיטת 0.05>p(.,() )3=n western-blot 120 N.S. 100 80 60 40 20 0 Vehicle 10 min 25 min 1.5hr 3hr 6hr 12hr 24hr SF Insulin איור 13. הכמות היחסית של החלבון AKT נשמרת לאחר טיפול בתאי L6 עם.EMM-45 33

dglc Uptake (percent of control) בכדי לאמת כי EMM-45 אכן מפעיל את האנזים AMPK נעשה שימוש במעכב פרמקולוגי של האנזים- 6-[4-(2-Piperidin-1-yl-ethoxy)-phenyl)]-3-pyridin-4-ylpyrrazolo[1,5-a]-,25.(Compound (C pyrimidine זהו מעכב הפיך של האנזים, אשר מתחרה עם ATP על אתר הקישור 26. המעכב Compound C הקטין באופן משמעותי את יכולת החומר EMM-45 להגביר את קצב כניסת הגלוקוז בסיבי שריר שלד )איור 14(, בהשוואה לתאי בקרה אשר הודגרו ללא נוכחות המעכב. כלומר.AMPK מגביר את קצב קליטת הגלוקוז על ידי הפעלת האנזים EMM-45 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Vehicle Compound C EMM 45, 37.5µM EMM 45, 37.5µM+ Compound C איור EMM-45 14. מגביר את קצב כניסת הגלוקוז לסיבי שריר השלד על ידי הפעלת.AMPK תאי ה L6 הודגרו במדיום המכיל 25 mm גלוקוז וחלק מהתאים הודגרו תחילה עם המעכב µm) Compound C 10) למשך שעה, ובשלב הבא לחלק מהתאים הוסף גם החומר EMM-45 37.5( µm( עד ל- 24 שעות. בתום ההדגרה התאים נשטפו עם PBS בטמפרטורת החדר והודגרו עם אנלוג הגלוקוז [ 3 H]-2dGlc וקצב קליטתו נקבע כמפורט בפרק השיטות. )3=n 0.05>p(.,() 34

Insulin Secretion (Percent of content) בדיקת השפעת החומר EMM-45 על הפרשת האינסולין בתאי בטא בהמשך העבודה נבדקה האפשרות כי החומר המוביל,EMM-45 אשר הגביר את קצב קליטת הגלוקוז לתאי שריר שלד, עשוי להגביר גם את מידת הפרשת האינסולין משורת תאי הבטא.INS-1E הקו המנחה היה חיפוש אחר חומר ייחודי אשר יפעל על שני המרכיבים לטיפול בסוכרת- הגברת קצב כניסת הגלוקוז לתאי שריר שלד מצד אחד, והגברת הפרשת האינסולין מתאי בטא מצד שני. לשם כך, נבחנה השפעתו של החומר EMM-45 על הפרשת האינסולין במודל שורת תאי בטא בתרבית, וכן השפעתו על חיות התאים. EMM-45 הגביר את הפרשת האינסולין מתאי באופן תלוי מנה וזמן )איור 15(. בבדיקת טווח ריכוזים של INS-1E בהדגרה למשך שעות, ניתן לראות כי החומר הגביר את הפרשת האינסולין פי 2 בריכוז 5 0.5-100 µm אפקטיבי של 25 µm )איור 15A(. מעניין לציין כי בריכוזים הגבוהים יותר µm) 75-100) נצפתה ירידה בהפרשת האינסולין. בבדיקת פעילות החומר EMM-45 בריכוז 25 µm לאורך זמן, נמצא כי ההגברה בהפרשת האינסולין החלה כבר כעבור שעות והגיעה להשפעה מקסימלית לאחר 12 שעות הדגרה, 2.5 ונמשכה עד כדי )איור שעות ניתן לראות כמו כן, הגביר כי EMM-45 את הפרשת האינסולין.)15B 48 בחשיפה לריכוזי גלוקוז גבוהים בלבד mm) 16.7). A 6 5 4 3 2 1 0 c DMSO 0.5 1 5 10 25 50 75 100 EMM 45 (µm) 35

Insulin Secretion (Percent of content) B 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 c DMSO 2.5 5 12 24 48 Time (hr) 3.3mM Glucose 16.7mM Glucose איור 15. החומר EMM-45 הגביר שחרור אינסולין מתאי בטא. )A( אנליזת השפעת EMM-45 בתלות במנה. תאי ה INS- 1E הודגרו במדיום המכיל 11 mm גלוקוז עם ריכוזים עולים של החומר EMM-45 למשך 5 שעות. תרביות הבקרה הודגרו במדיום הגידול הרגיל וכביקורת נוספת הוגדרו בנוכחות הממס DMSO לאותו פרק זמן. בסיום החשיפה לחומר, התאים נשטפו, והודגרו עם בופר KRBH המכיל 3.3 mm גלוקוז למשך שעה, ולאחר מכן לשעה נוספת בבופר דומה המכיל 16.7 mm גלוקוז. בסוף שתי ההדגרות נאסף הבופר ושימש לקביעת רמות האיסולין שהופרשו מהתאים כתלות בשני ריכוזי הגלוקוז. תכולת האינסולין בתאים נקבעה על ידי מיצוי התאים. הפרשה ותכולת האינסולין בתאים כומתו באמצעות שיטת.RIA הפרשת האינסולין מוצגת כאחוז מתכולת האינסולין בתאים. )B( אנליזת השפעתו של EMM-45 בתלות בזמן. תאי ה- INS-1E הודגרו במדיום המכיל 11 mm גלוקוז עם החומר EMM-45 בריכוז 25. µm תרביות הבקרה הודגרו רק בנוכחות הממס.DMSO לאחר ההדגרה נמדדה הפרשת האינסולין בתגובה ל mm 3.3 או 16.7 mm גלוקוז מתאי ה-,INS-1E ובסיום נקבעה תכולת האינסולין בתאים. הפרשה ותכולת האינסולין בתאים כומתו באמצעות שיטת.RIA הפרשת האינסולין מוצגת כאחוז מתכולת האינסולין בתאים..)p<0.05 (), n=3( 24 החומר EMM-45 לא פגע בחיות התאים בחשיפה לפרקי זמן של ו- 48 שעות בריכוז הפעיל (75-100 µm) בריכוזים הגבוהים יותר.(25 µm) נצפה מוות של התאים )איור 16(. תוצאה זו יכולה להסביר את הירידה בהפרשת האינסולין בעקומת מנה תגובה )איור 15A(. 36

Cell Viability (Percent of control) 120 100 48H 24H 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 EMM 45 (µm) איור 16. קביעת השפעתו של EMM-45 על תמותת תאי הבטא. תאי ה INS-1E הודגרו בנוכחות החומר EMM-45 בטווח ריכוזים של -5 100µM למשך 24 שעות ו - 48 שעות. לאחר ההדגרה נמדדה רעילותו )הציטוטוקסיות( באמצעות שיטת ה-.(p<0.05 (), n=4). כפי שפורט בפרק השיטות.,MTT מנגנון הפעולה של EMM-45 בתאי בטא בבדיקת השפעות החומר EMM-45 על תאי שריר שלד ותאי בטא, נמצא כי הוא בעל השפעה כפולה על שתי מטרות אלו. לכן בהמשך העבודה נבדק מנגנון הפעולה של חומר זה גם בתאי הבטא מפרישי האינסולין, בכדי לבדוק האם גם באתר פעולה זה ההשפעה המתקבלת על הפרשת האינסולין קשורה גם היא בהפעלת AMPK EMM-45 האנזים.AMPK בכדי לבדוק האם מפעיל את גם בתאי הבטא, אנליזת בוצעה תוך שימוש בנוגדן ספציפי לתת היחידה α של האנזים, העוברת זרחון כאשר ה- AMPK,Western blot מופעל. כבקרה חיובית נעשה שימוש במפעיל,AMPK החומר 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1- חומר זה עובר מטבוליזם על ידי האנזים Adenosine kinase והופך.)AICAR( β-d-ribofuranoside 37

ZMP.(ZMP) לנוקלאוטיד 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranotide הוא 17 אנאלוג של AMPK ובדומה לו עובר אינטרקציה עם,AMP 24 וגורם להפעלתו של אנזים זה. באיור AMPKα Thr 172 ניתן לראות כי כמצופה הבקרה AICAR החיובית גרמה לזרחון משמעותי של באנזים בתאי ה-.INS-1E גם החומר EMM-45 הביא לזרחון של תת היחידה α, מבלי להשפיע על התכולה התאית הכללית של AMPKα )איור 18(. ההשפעה של EMM-45 החלה תוך זמן קצר של כ- 10 דקות ונמשכה לאורך זמן של 24 שעות. לפיכך, הפעלת האנזים AMPKα קודמת להגברה המירבית של הפרשת האינסולין INS-1E L6 מתאי הבטא. יש לציין כי ותאי תאי שורת הגיבו בצורה שונה לבקרות החיוביות )שוק ההיפראוסמולרי ו-,)AICAR דבר שנקבעה בצורה אמפירית בניסוי מקדים. לכן הוחלפה הביקורת החיובית במעבר בין שורות התאיםי בכדי לבדוק את הקשר בין הפעלת האנזים AMPK בתאי הבטא לבין ההשפעה המתקבלת על הפרשת האינסולין נעשה שימוש גם בחלק זה במעכב הפרמקולוגי של האנזים-.Compound C ניתן לראות כי המעכב הקטין באופן משמעותי את יכולת החומר EMM-45 להגביר את הפרשת האינסולין מתאי הבטא בהשוואה לתאי ביקורת שהודגרו עם EMM-45 ללא נוכחות המעכב )איור 19(. כלומר EMM-45 מגביר את הפרשת האינסולין בתאים אלו על ידי הפעלת האנזים.AMPK 38

Total AMPK/ Tubulin (Percent of control) Relative Density (percent of control) pthr 172 -AMPKα Total AMPK-α Tubulin 300 250 200 150 100 50 0 Vehicle Aicar 10min 25min 45min 1.5H 3H 6H 12H 24H 48H איור EMM-45 17. מפעיל את האנזים AMPK באופן תלוי-זמן. תאי ה INS-1E הודגרו במדיום המכיל 11 mm גלוקוז כאשר חלק מהתאים נחשפו לחומר EMM-45 25( µm( בטווח זמנים בין 10 דקות ל 48 שעות, וחלק מהתאים נחשפו לאגוניסט ידוע של האנזים AMPK החומר 4( mm, 1 hr( AICAR כבקרה חיובית. תרביות התאים נקצרו, החלבונים הופרדו על ידי אלקטרופורזה, והתוצאות נותחו באמצעות שיטת 0.05>p(.,() )3=n.western-blot 140 N.S. 120 100 80 60 40 20 0 Vehicle AICAR 10min 25min 45min 1.5hr 3hr 6hr 12hr 24hr 48hr איור 18. הכמות היחסית של החלבון AMPK נשמרת לאחר טיפול בתאי L6 עם.EMM-45 39

Insulin secretion (Percent of Content) 12 10 8 6 4 2 0 Vehicle EMM 45, 25μM Compound C EMM 45, 25μM+ Compound C 3.3mM Glucose 16.7mM Glucose איור 19. החומר EMM-45 מגביר את הפרשת האינסולין על ידי הפעלת.AMPK תאי ה INS-1E הודגרו במדיום המכיל 11 mm גלוקוז וחלק מהתאים הודגרו תחילה עם המעכב µm) Compound C 2.5) למשך שעה, ובשלב הבא לחלק מהתאים הוסף גם החומר EMM-45 25( µm( עד ל - 24 שעות. לאחר ההדגרה נמדדה הפרשת האינסולין בתגובה ל mm 3.3 או 16.7 mm גלוקוז מתאי ה,INS-1E ובסיום נקבעה תכולת האינסולין בתאים. הפרשה ותכולת האינסולין בתאים כומתו באמצעות שיטת,RIA כפי שפורט בפרק השיטות. )3=n 0.05>p(.,() 40

דיון: עקב המגבלות הקיימות בתרופות ובטיפולים בסוכרת מסוג 2, יחד עם שכיחותה הגוברת של המחלה באוכלוסייה, מושקע מחקר רב מ כדי למצוא ולשפר את הטיפול התרופתי במחלה. במעבדתנו )בשיתוף פעולה עם דר' אריה גרוזמן( פותחו סדרות חדשות של חומרים בעלי אפשרות עתידית לשימוש כבסיס לפיתוח תרופתי עבור המחלה. בין סדרות אלו, נחקרו חומרים מסדרת ה-,ethoxybenzo-thiazol ובנוסף מספר חומרים חדשים שהינם נגזרות משופרות של החומר.EH-36 מטרתה הראשונה של עבודה זו הייתה לבחון את השפעות החומרים החדשים על קצב כניסת הגלוקוז לתאי שריר שלד, ולאחר מכן לבדוק מהו החומר הפעיל והיעיל ביותר ולאפיין את מנגנון פעולתו. תוצאות העבודה מראות כי אכן לחומרים השונים שנבדקו יש פוטנציאל להמשך פיתוח, ומתוכם הפעילות הבולטת ביותר הייתה לחומר EMM-45 מסדרת ה-.ethoxybenzo-thiazol חומר זה הראה תכונות פעילות ויעילות הטובות ביותר. גם ליתר החומרים הייתה השפעה על קצב קליטת הגלוקוז, ובימים אלו מתבצעת אנליזת מבנה פעילות,in-silico על מנת לבחון מהו המוטיב )פרמקופור( ההכרחי להגברת קליטת הגלוקוז בתאי שריר השלד. בהמשך הפרויקט, המטרה היא לנסות ולמצוא את החומר הטוב ביותר לפיתוח התרופתי עבור סוכרת מסוג 2. מטרה שנייה בעבודה הייתה לבחון את ה אפשרות כי לחומר EMM-45 יש השפעות גם באתר מטרה נוסף- תאי הבטא בלבלב, ואכן EMM-45 העלה את יכולת הפרשת האינסולין מתאי הבטא.INS-1E מטרה נוספת הייתה לאפיין ולחקור את מנגנון הפעולה של EMM-45 בתאי שריר שלד ובתאי הבטא. נמצא כי החומר מגביר את כמות נשאי ה- GLUT4 על פני הממברנה על ידי הפעלה של האנזים,APMK בדומה 19 גם בתאי הבטא EMM-45. EH-40 לחומרים EH-36 ו- מפעיל את,AMPK וככל הנראה גורם בכך להגברה של הפרשת האינסולין. 41

פעולתו של EMM-45 בתאי שריר שלד הבעיה העיקרית במחלת הסוכרת מסוג 2 היא התנגודת ההיקפית לאינסולין, וכתוצאה מכך עליה ברמות 2 הגלוקוז בדם. לנשא GLUT4 יש תפקיד מרכזי בשמירה על רמות גלוקוז תקינות בדם. על פי Stenbit et,al. בעכברי -/+ GLUT4 הטרוזיגוטיים נצפתה ירידה בביטוי הנשא GLUT4 בתאי שריר שלד ורקמות שומן, ירידה בקליטת הגלוקוז בתאי שריר ותנגודת היקפית לאינסולין 27 ובעקבותיה עלייה ברמות הגלוקוז בדם. כאשר נעשה שימוש בעכברים טרנסגניים המבטאים את הנשא GLUT4 ביתר, נצפתה הגברה ברגישות 28 לאינסולין ועלייה בקצב קליטת הגלוקוז לשריר השלד. הליקויים בהכנסת הגלוקוז לתאי שריר השלד מקושרים בעיקר לפגמים במסלול העברת האותות של האינסולין, וככל הנראה נגרמים בעקבות שינויים בבקרה על העברת הנשא GLUT4 29 אל פני הממברנה. על כן, חומרים הפועלים במנגנון העברת אותות שאינו תלוי אינסולין, וגורמים לגיוס של כמות נשאי GLUT4 תקינה לפני הממברנה, הם בעלי יתרון בפיתוח התרופתי עבור טיפול במחלה. מעניין לציין את הניסוי בו ההדגרה עם EMM-45 הגבירה את קליטת הגלוקוז לסיבי שריר השלד על ידי העלאת כמות נשאי ה- GLUT4 על פני הממברנה. יתר על כן, כאשר הסיבים נחשפו לחומר יחד עם אינסולין, התקבלה השפעה מסכמת )אדיטיבית( של העלייה בכמות הנשאים. תוצאה זו מרמזת על קיום מסלול אותות שונה של החומר,EMM-45 כלומר, פעולתו של חומר זה מתווכת על ידי מנגנון שאינו תלוי אינסולין. אינסולין גורם להעברת הנשא GLUT4 אל פני הממברנה על ידי הפעלה של הקולטן לאינסולין ושרשרת העברת האותות הכוללת את החלבונים PI3K,IRS ו-.Akt לעומת זאת, ישנם תהליכים שונים כגון כיווץ שרירים או מצבי עקה אשר גורמים במסלול שונה לפעולה דומה של העברת הנשא אל פני הממברנה, וזאת על ידי הפעלת האנזים AMPK,13 30. מחקירת מנגנון הפעולה של החומר,EMM-45 נראה כי הוא גורם לזרחון האנזים AMPK והפעלתו, אך אינו גורם להפעלה של החלבון,Akt שהינו בעל תפקיד חשוב במסלול העברת האותות תלוי האינסולין.,Compound C ב- השימוש מעכב האנזים, לירידה גרם ביכולתו של EMM-45 להעלות את קצב קליטת הגלוקוז בסיבי השריר שלד. לפיכך, ישנה אפשרות כי EMM-45 מעלה את מספר נשאי ה- GLUT4 על פני הממברנה הפלסמתית על ידי הפעלת מסלול האותות 42

AMPK של.AMPK קיימים בספרות דיווחים רבים לגבי ההשפעה האדיטיבית של מפעילי האנזים ואינסולין על העלאת כמות נשאי ה- GLUT4,24 על פני הממברנה והגברת קצב קליטת הגלוקוז בשרירי שלד AMPK 31-33. השלב המשותף במסלולי העברת האותות התוך תאיים של אינסולין ו- הוא זרחון של החלבונים AS160/TBC1D4 ו-,TBC1D1 אשר מביא אותם למצב פעיל פחות. כאשר אלו החלבונים מצויים נמצאים בקרבת הם הפעיל במצבם וזיקולות האחסון של הנשא.GLUT4 בתגובה לאינסולין או GTPase הפעלת,AMPK הם עוברים זרחון, אשר גורם לעיכוב פעילות ה- שלהם. בתגובה לכך,ישנה תנועה של וזיקולות האחסון, עגינה ואיחוי 34-36 עם הממברנה. הקשר בין הפעלת האנזים AMPK להגברת קליטת הגלוקוז על פי תוצאות עבודה זו, נראה כי חשיפת התאי L6 לחומר EMM-45 גרמה להפעלת האנזים AMPK תוך זמן קצר של 10 דקות ורמות הזרחון נשמרו ברמה גבוהה למשך 24 שעות. ההשפעה על קצב קליטת הגלוקוז לתאים נצפתה כעבור כ- 3 שעות והגיעה לשיאה לאחר 5 שעות, אפקט אשר נשמר גם לאחר 24 שעות. מכך ניתן להסיק כי הפעלת האנזים AMPK קודמת לעליה בכניסת הגלוקוז לתאים. כמו כן ישנה התאמה בין משך הפעלתו של האנזים למשך ההשפעה על עלייה בכניסת הגלוקוז לתאים. קיימים דיווחים בספרות כי הפעלה של AMPK על ידי פעילות ספורטיבית או שימוש במפעילים פרמקולוגיים של האנזים גורמת לעלייה 37-39,24 בשעתוק הנשא GLUT4 ובעיסוק בפעילות ספורטיבית באופן קבוע או מתן כרוני של מפעילי נצפתה עלייה במאגרי GLUT4,AMPK 37,11 התוך תאיים. הגברת קצב כניסת הגלוקוז לתאי שריר השלד מתקבלת עקב עלייה בכמות נשאי ה- GLUT4 על פני הממברנה. במצב בסיסי, יש מספר מועט של נשאים 33 על פני ממברנת התא, עקב קצב אנדוציטוזה מהיר לעומת האקזוציטוזה. לכן באופן תיאורטי, ניתן להעלות את כמות הנשאים במספר דרכים, לדוגמא: העלאת קצב האקזוציטוזה של הוזיקולות, הפחתת האנדוציטוזה והגדלת כמות הנשאים במאגרים התוך תאיים. אינסולין גורם להפעלת תהליכי אקזוציטוזה באופן תלוי AS- 160 40 ובכך מעלה את כמות הנשאים בממברנה. בנוסף הן לאינסולין והן למפעילי AMPK יש תפקיד חשוב,33 בהפחתת האנדוציטוזה של ה- GLUT4 41. הפעלה של האנזים AMPK גורמת להגברת כמות נשאי 43